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Cette Ligne directrice décrit une procédure in vitro qui peut être utilisée pour identifier les dangers présentés par les produits chimiques irritants (substances et mélanges) conformément à la Catégorie 2 du Système général harmonisé de classification et d’étiquetage (SGH) de l’ONU. Elle s’appuie sur un épiderme humain reconstitué, qui dans sa conception globale, reproduit les propriétés biochimiques et physiologiques de la partie supérieure de la peau humaine. La viabilité cellulaire est mesurée par la conversion enzymatique du colorant vital MTT en un sel de formazan bleu, qui est mesuré quantitativement après extraction des tissus. Les substances d’essai irritantes sont identifiées par leur capacité à réduire la viabilité cellulaire au dessous d’un seuil défini (inférieur ou égal à 50% pour la Catégorie 2 du SGH de l’ONU). Cette Ligne directrice comprend aussi des normes de performance pour l’évaluation de méthodes d’essai similaires ou modifiées sur épiderme humain reconstitué. Trois méthodes d’essai validées sont conformes à cette Ligne directrice. En fonction du cadre législatif et du système de classification utilisé, cette procédure peut être utilisée pour déterminer l’irritation cutanée de substances d’essai, en tant qu’essai de substitution d’essai d’irritation cutanée in vivo, ou en tant qu’essai de substitution partiel, dans le cadre d’une stratégie d’essai à plusieurs niveaux.

The in vitro micronucleus test is a genotoxicity test for the detection of micronuclei in the cytoplasm of interphase cells. Micronuclei may originate from acentric chromosome fragments (i.e. lacking a centromere), or whole chromosomes that are unable to migrate to the poles during the anaphase stage of cell division. The assay detects the activity of clastogenic and aneugenic test substances in cells that have undergone cell division during or after exposure to the test substance. This Test Guideline allows the use of protocols with and without the actin polymerisation inhibitor cytochalasin B. Cytochalasin B allows for the identification and selective analysis of micronucleus frequency in cells that have completed one mitosis, because such cells are binucleate. This Test Guideline also allows the use of protocols without cytokinesis block provided there is evidence that the cell population analysed has undergone mitosis.

Cette Ligne directrice est conçue pour évaluer les effets d’une substance sur les microorganismes de boue activée de station d’épuration en mesurant le taux de respiration (oxydation du carbone et/ou de l’ammonium) par la consommation d’oxygène. Les résultats de l’essai peuvent servir d’indicateurs de concentrations non inhibitrices à utiliser dans les essais de biodégradation. L’essai permet de déterminer les valeurs CEx et ou CSEO pour la substance d’essai. L’inhibition de trois différentes consommations d’oxygène peut être déterminée: totale, hétérotrophique seulement, et celle due à la nitrification en absence et présence de N-allylthiourée, un inhibiteur spécifique de nitrification. Pour obtenir une CSEO et une CEx, il est recommandé d’utiliser 5 concentrations d’essai appartenant à une série géométrique avec 5 réplicats et 6 témoins. Dans chaque récipient d’essai, des mélanges d’essai contenant de l’eau, de l’eau usée reconstituée et la substance d’essai sont incubés à pH 7.5 ±0.5 et à une température de 20±2°C, sous aération forcée, pour maintenir la concentration en oxygène dissous au dessus de 60-70% de saturation. La consommation d’oxygène est mesurée après 3 heures d’exposition et des mesures supplémentaires de 30 minutes peuvent être ajoutées au cas où la substance soit dégradée rapidement.

Cette Ligne directrice est conçue pour évaluer les effets d'une exposition prolongée à des produits chimiques sur le cycle de vie du Chironomus sp., un diptère vivant dans les sédiments d'eau douce. Des chironomes au premier stade larvaire sont exposés à une gamme de cinq concentrations de la substance d'essai dans un système sédiment-eau. L'essai débute par l'introduction de larves du premier stade (1ère génération) dans des béchers expérimentaux contenant du sédiment chargé. Il est également possible d’injecter la substance d’essai dans l’eau après l’introduction des larves. L’émergence des chironomes, le délai d’émergence et le sex-ratio des moucherons complètement émergés et vivants sont évalués. Les adultes émergés sont transférés dans des cages d’élevage pour faciliter l’essaimage, l’accouplement et la ponte. Le nombre d’amas d’œufs et leur fertilité sont évalués. Ces amas d’œufs produisent les larves du premier stade de la 2ème génération. Ces larves sont placées dans des béchers expérimentaux fraîchement préparés (les récipients sont chargés de la même façon que pour la 1ère génération) afin de déterminer la viabilité de la 2ème génération via l’évaluation de l’émergence des chironomes, du délai d’émergence et du sex-ratio des moucherons complètement émergés et vivants. Toutes les données sont analysées, soit en utilisant un modèle de régression pour estimer la concentration qui entraînerait une réduction de x % de l’effet mesuré, soit en ayant recours à un test d’hypothèse pour déterminer une concentration sans effet observé (CSEO). Cette dernière méthode nécessite une comparaison des réponses au traitement avec les réponses témoins adéquates à l’aide de tests statistiques.

The Local Lymph Node Assay: DA (LLNA: DA) is a non-radioactive modification to the LLNA method for identifying potential skin sensitizing test substances and measuring the proliferation of lymphocytes they induce in the auricular lymph nodes. The method, described in mouse (CBA/J strain), is based on measurement of the adenosine triphosphate (ATP) content by bioluminescence as an indicator of this proliferation. A minimum of four animals is used per dose group, with a minimum of three concentrations of the test substance, plus a concurrent negative control group and, if appropriate, a positive control group. The experimental schedule is during 8 days. The time from animal sacrifice to measurement of ATP should not exceed 30 min. The procedure from excision of lymph nodes to ATP measurement should be kept uniform for each animal and completed within 20 minutes. The luciferin/luciferase method is applied to measure the bioluminescence in Relative Luminescence Units (RLU). This study includes: measurements (weighing, RLU), and clinical daily observations. The results are expressed as the Stimulation Index (SI) obtained by calculation. The SI should be ¡Ý1.8 before further evaluation of the test material as a potential skin sensitizer is warranted.

L'essai de stimulation locale des ganglions lymphatiques (ELGL) chez la souris repose sur le principe suivant: les sensibilisants induisent une prolifération primaire de lymphocytes dans les ganglions lymphatiques auriculaires qui drainent le site de l'application de la substance chimique. Cette prolifération est proportionnelle à la dose appliquée et fournit une mesure de la sensibilisation. La méthode décrite s’appuie sur l'utilisation du marquage radioactif pour mesurer la prolifération cellulaire. Quatre animaux au minimum sont utilisés par groupe de dose, avec au minimum trois concentrations de la substance d'essai, plus un groupe contrôle négatif traité avec le véhicule, et, au besoin, un contrôle positif. Le programme expérimental dure 6 jours. Ensuite, les animaux sont tués et une suspension de cellules de ganglion lymphatique est préparée. L'incorporation de la 3H-méthylthymidine se mesure par comptage à ß scintillation en désintégrations par minute (DPM). La Ligne directrice comprend des normes de performance pour la validation de méthodes d’essai nouvelles et/ou modifiées, similaires à l’ELGL sur le plan fonctionnel et mécanistique. Une version simplifiée de l’ELGL, optionnelle, permet de réduire de 40% le nombre d’animaux utilisés. Cette étude inclut des mesures (pesée, DPM) et des observations cliniques quotidiennes. Les résultats sont exprimés par l'indice de stimulation (IS). L’IS est obtenu par calcul et justifie une classification de la substance d’essai comme sensibilisant de la peau s’il est ≥3.

Cette Ligne directrice décrit des études « in vivo » qui fournissent des informations sur le bilan massique, l’absorption, la biodisponibilité, la distribution tissulaire, le métabolisme, l’excrétion, et les principaux paramètres toxicocinétiques (par exemple AUC), ainsi que des approches supplémentaires qui peuvent fournir des informations utiles sur la toxicocinétique. Les informations sur la toxicocinétique aident à relier la concentration ou la dose à la toxicité observée et à comprendre son mécanisme de toxicité. La substance d’essai (radiomarquée ou non) est normalement administrée par voie orale, mais d’autres voies d’administration sont possibles. L’administration de doses uniques de la substance (de préférence un minimum de deux niveaux de doses) peut convenir, mais des doses répétées peuvent être nécessaires dans certaines circonstances. Les études utilisent de préférence la même espèce que celle utilisée dans d’autres études toxicologiques faites avec la substance (normalement le rat, un minimum de 4 animaux d’un même sexe pour chaque dose). Une estimation initiale de l’absorption peut être obtenue par la détermination du bilan massique; mais il est possible que d’autres études, telles que les études avec administration en intraveineuse (IV) et excrétion biliaire, soient nécessaires. La biodisponibilité peut être déterminée à partir des cinétiques plasma/sang des groupes oraux et IV. Le pourcentage de la dose totale dans les tissus est au moins mesuré à la fin de l’essai, mais des mesures à d’autres moments peuvent s’avérer nécessaires. Les métabolites présents à 5 % ou plus de la dose administrée sont identifiés. Le taux et l’importance de l’excrétion de la dose administrée sont déterminés par la mesure du pourcentage de dose récupéré dans l’urine, les fèces et l’air expiré.

The basic principle underlying the Local Lymph Node Assay (LLNA) in mouse is that sensitizers induce a primary proliferation of lymphocytes in the auricular lymph nodes draining the site of chemical application. This proliferation is proportional to the dose applied and provides a measurement of sensitisation. The method described is based on the use of radioactive labelling to measure cell proliferation. A minimum of four animals is used per dose group, with a minimum of three concentrations of the test substance, plus a negative control group treated with the vehicle only, and a positive control, as appropriate. The experimental schedule of the assay is during 6 days. Thereafter, the animals are killed and a cell suspension of lymph node cells is prepared. The incorporation of 3H-methyl thymidine is measured by ¦Â-scintillation counting as disintegrations per minute (DPM). The Test Guideline includes performance standards that can be used to evaluate the validation status of new and/or modified test methods that are functionally and mechanistically similar to the LLNA. A reduced LLNA approach which could use up to 40% fewer animals is also described as an option. This study includes: measurements (weighing, DPM), and clinical daily observations. Results are expressed as the Stimulation Index (SI).The SI is obtained by calculation and should be ¡Ý3 before classification of the test material as a skin sensitizer is warranted.

This Test Guideline describes in vivo studies that provide information on mass balance, absorption, bioavailability, tissue distribution, metabolism, excretion, and basic toxicokinetic parameters [e.g. AUC], as well as supplemental approaches that may provide useful information on toxicokinetics. Information from toxicokinetic studies helps to relate concentration or dose to the observed toxicity and to understand its mechanism of toxicity. The test substance ("unlabelled" or "radiolabelled" forms) is normally administered by an oral route, but other routes of administration may be applicable. Single dose administration of the substance (preferably a minimum of two dose levels) may be adequate, but repeated dose may be needed in some circumstances. Toxicokinetic studies should preferably be carried out in the same species as that used in other toxicological studies performed with the substance (normally the rat, a minimum of 4 animals of one sex for each dose). Initial estimation of absorption can be achieved by mass balance determination, but further investigations such as intravenous (IV) administration and biliary excretion studies might be necessary. Bioavailability can be determined from plasma/blood kinetics of oral and IV groups. The percent of the total dose in tissues should at a minimum be measured at the termination of experiment,but additional time points may also be needed. Metabolites present at 5 % or greater of the administered dose should be identified. The rate and extent of excretion of the administered dose should be determined by measuring the percent recovered dose from urine, faeces and expired air.

This Test Guideline describes procedures designed to assess bioaccumulation of chemicals in soil oligochaetes. The parameters which characterise the bioaccumulation of a substance include the bioaccumulation factor (BAF), the uptake rate constant (ks) and the elimination rate constant (ke). The test consists of two phases: the uptake (exposure) phase and the elimination (post-exposure) phase. An elimination phase is always required unless uptake of the test substance during the exposure phase has been insignificant. The test organisms are exposed to the test substance during the uptake phase. The test substance is incorporated into the soil; it is recommended to use the artificial soil described in the OECD Test Guideline 207 (Earthworm, acute toxicity test). The uptake phase should be of 14 days (enchytraeids) or 21 days (earthworms) unless it is demonstrated that steady state has been reached. For the elimination phase, the worms are transferred to a soil free of test substance. The elimination phase is generally of 21 days.

Cette Ligne directrice pour les essais décrit les procédures à suivre pour évaluer la bioaccumulation de substances chimiques dans les oligochètes du sol. Les paramètres qui caractérisent la bioaccumulation d’une substance se composent du facteur de bioaccumulation (FBA), de la constante de vitesse d’absorption (ks) et de la constante de vitesse d’élimination (ke). L’essai consiste en deux phases, la phase d’absorption (exposition) et la phase d’élimination (post-exposition). Une phase d’élimination est toujours nécessaire sauf si l’absorption de la substance d’essai au cours de la phase d’exposition s’avère non significative. Les organismes d’essai sont exposés à la substance d’essai durant la phase d’absorption. La substance d’essai est incorporée dans le sol; il est recommandé d’utiliser le sol artificiel décrit dans la Ligne directrice de l’OCDE 207 (Ver de terre, essai de toxicité aiguë). La phase d’absorption dure 14 jours (enchytrées) ou 21 jours (vers de terre) sauf s’il est prouvé que l’état stationnaire a été atteint. Pour la phase d’élimination, les vers sont transférés sur un sol dépourvu de la substance d’essai. La phase d’élimination dure généralement 21 jours.

L’essai de stimulation locale des ganglions lymphatiques: DA (ELGL:DA) est une variante non radioactive de la méthode ELGL qui vise à identifier les substances chimiques sensibilisantes et à mesurer la prolifération lymphocytaire qu’ils induisent dans les ganglions lymphatiques auriculaires. Cette méthode, décrite chez la souris (de souche CBA/J), se base sur la quantification par bioluminescence du contenu en adénosine triphosphate (ATP), indicateur de cette prolifération. Quatre animaux au minimum sont utilisés par groupe de dose, avec au minimum trois concentrations de la substance d'essai, plus un groupe contrôle négatif traité seulement avec le véhicule, et au besoin un contrôle positif. Le protocole expérimental dure 8 jours. La teneur en ATP doit être quantifiée dans les 30 minutes qui suivent l’euthanasie. La procédure appliquée, de l’excision des ganglions lymphatiques au dosage de l’ATP, doit être identique pour chaque animal et ne doit pas excéder 20 minutes. La méthode luciférine/luciférase est appliquée pour quantifier la bioluminescence exprimée en unités relatives de luminescence (RLU). L’essai inclut des mesures (pesée, RLU) et des observations cliniques quotidiennes. Les résultats sont exprimés par l’Indice de Stimulation (IS), qui est obtenu par calcul. Une évaluation complémentaire de la substance d’essai comme sensibilisant potentiel est justifiée lorsque SI ≥1.8.

This Test Guideline is designed to assess the effects of a substance on micro-organisms from activated sludge of waste-water treatment plants by measuring their respiration rate (carbon and/or ammonium oxidation) as oxygen consumption. The test results may also serve as an indicator of suitable non-inhibitory concentrations of test substances to be used in biodegradability tests. The test allows the determination of ECx and/or NOEC values of the test substance. The inhibition of three different oxygen uptakes may be determined, i.e. total, heterotrophic only, and that due to nitrification in the absence and presence of N-allylthiourea, a specific nitrification inhibitor. For obtaining both NOEC and ECx, six controls and five treatment concentrations in a geometric series with five replicates are recommended. In each test vessel, test mixtures containing water, synthetic sewage feed and the test substance are incubated at the pH of 7.5 ±0.5 and the temperature within 20±2°C under forced aeration to keep the dissolved oxygen concentration above 60-70% saturation. The oxygen consumption is measured after 3 hours of exposure and additional measurements at 30 minutes of exposure can be performed in the case that the test substance is rapidly degraded.

This Guideline is designed to assess the effects of prolonged exposure of chemicals to the life-cycle of the sediment-dwelling freshwater dipteran Chironomus sp. First instar chironomid larvae are exposed to five concentrations of the test chemical in sediment-water systems. The test substance is spiked into the water or alternatively the sediment, and first instar larvae are subsequently introduced into test beakers in which the sediment and water concentrations have been stabilised. Chironomid emergence, time to emergence, and sex ratio of the fully emerged and alive midges are assessed. Emerged adults are transferred to breeding cages, to facilitate swarming, mating and oviposition. The number of egg ropes produced and their fertility are assessed. From these egg ropes, first instar larvae of the 2nd generation are obtained. These larvae are placed into freshly prepared test beakers (spiking procedure as for the 1st generation) to determine the viability of the 2nd generation through an assessment of their emergence, time to emergence and the sex ratio of the fully emerged and alive midges. All data are analysed either by a regression model to estimate the concentration that would cause X% reduction in the relevant endpoint, or by using hypothesis testing to determine a No Observed Effect Concentration (NOEC).

This publication offers a general introduction to sustainability impact assessment, which is an approach for exploring the combined economic, environmental and social impacts of a range of proposed policies, programmes, strategies and action plans. Such assessments can also assist decision-making and strategic planning throughout the entire policy cycles. It is not an in-depth or detailed user manual, but rather outlines basic principles and process steps of sustainability impact assessments, drawing on examples from Switzerland, Belgium and the European Commission, among others. This publication is a valuable source of information for policy makers on sustainability impact assessments.