This study relates to the analysis, via dermal application, of the health hazards of solid or liquid test substance. It may be carried out after initial information obtained by acute testing.

This method is composed of the main test and the limit test. This Test Guideline is intended for use with the adult rat, rabbit or guinea pig. At least 20 animals (10 female and 10 male) with healthy skin should be used at each dose level (at least three). The highest dose level should result in toxic effects but not produce an incidence of fatalities. The limit test corresponds to one dose level of at least 1000 mg/kg body weight. The method is based on the repeated application of the substance of interest during one limited period (several hours daily during 90 days). The test substance should be applied over not less than 10 per cent of the body surface area. The results of this study include: measurements and daily and detailed observations (ophthalmological examination, haematology, clinical biochemistry and urinalysis), as well as gross necropsy and histopathology. A properly conducted subchronic test should provide a satisfactory estimation of a non effect level.

This Test Guideline describes the methods allowing the determination of the dissociation constants in water. The dissociation is the reversible splitting into two or more chemical species which may be ionic.

The determination of the dissociation constant requires a measure of the concentrations of the dissociated and undissociated forms of the chemical substance. From a knowledge of the stoichiometry of the dissociation reaction the appropriate constant can be determined. In the particular case described in this Guideline the substance is behaving as an acid or a base, and the determination is most conveniently done by determining the relative concentrations of ionised and unionised forms of the substance and the pH of the solution. The relationship between these terms is given in the equation for pKa. Some compounds exhibit more than one dissociation constant. Some of the methods described are also suitable for non-acid/base dissociation. There are two basic approaches to the determination of pKa. One involves titrating a known amount of substance with standard acid or base, as appropriate; the other involves determining the relative concentrations of the ionised and unionised forms and their pH dependence. Methods based on those principles may be classified as titration, spectrophotometric and conductometric procedures.

This Test Guideline describes two methods. These tests are applicable only to water insoluble (solubility < 10-6 g/1) substances.

The first method described (Method A) is designed to provide information on the transportation and sedimentation of insoluble particles in water and air. There are several standard methods available which meet the sensitivity requirements: the sedimentation, the centrifugation or the coulter counter. The sample should be subjected to a simple light microscopic examination to determine the approximate nature of the particles. Data are obtained for a 3 size ranges ›200µm, ‹2 µm and the region 2to 200µm. Method A, which determines the effective hydrodynamic radius, Rs (only in the range 2 μm < Rs < 100 μm), can be used for both fibrous and non-fibrous particulates.

The Method B is used in the special case of materials which can form fibres, it is comparatively specialised, infrequently required and involves microscopic examination. Scanning (SEM) or transmission (TEM) electron microscopy are required. There is no standard procedure at present. The full length (l) and diameter (d) data are needed on fibre of dimensions d≥ 0.1µm and l≥ 5µm. Two histograms should be prepared based on examination of at least 50 fibres each.

This Test Guideline describes a method to determine the fat solubility of solid and liquid substances. The fat solubility of a substance is one of the data for evaluating the storage of lipid soluble materials in biological tissue.

This test method can only be applied to pure substances, non-reactive with triglyceride, which are stable at 50°C for at least 24 hours and which also are not appreciably volatile under the same conditions. The substance is dissolved in a liquid "standard fat" by stirring, and the saturation mass fraction of the substance is achieved by continued addition until a constant value for the mass fraction dependent variable is achieved as determined by a suitable analytical method.The methods use eight samples; each should be twice the quantity necessary for saturation as determined in the preliminary test. After adding a weighed amount of approximately 25 g of liquified and mixed standard fat, four flasks are stirred at 30°C (group I) and the other four at approximately 50°C (group II), each for at least one hour. All the flasks are stirred at 37°C, for liquids during 3 hours for two flasks of each group and for at least 24 hours for the last two flasks. At the end a sample is taken, weighed and the mass fraction is determined with different methods (photometric methods, gas chromatography, and extraction).

This Test Guideline describes a method which is an adaptation of the Soap and Detergent Association semi-continuous activated sludge (SCAS) procedure for assessing the primary biodegradation of alkyl benzene sulphonate. The test does not simulate those conditions experienced in a sewage treatment plant.

Activated sludge from a sewage treatment plant is placed in an aeration (SCAS) unit. The test compound (non-volatile, water soluble, organic, non-inhibitoring to bacteria at the test concentration) and settled domestic sewage are added, and the mixture is aerated for 23 hours. The aeration is then stopped, the sludge allowed to settle and the supernatant liquor is removed. The sludge remaining in the aeration chamber is then mixed with a further aliquot of test compound and sewage and the cycle is repeated. The above fill and draw procedure is repeated daily throughout the test. A high concentration of aerobic micro-organisms is used. The length of the test for compounds showing little or no biodegradation is indeterminate, but experience suggests that this should be at least 12 weeks. Biodegradation is established by determination of the dissolved organic carbon content of the supernatant liquor. This value is compared with that found for the liquor obtained from a control tube dosed with settled sewage only.

This Test Guideline describes methods for determining storage stability of a substance with respect to heat and air. Two methods are applicable to homogeneous solid and liquid substances and to mixtures of these: the accelerated storage test and the thermal analysis methods.

In the accelerated storage test (CIPAC), a long duration storage instability can be simulated by applying a higher temperature during a short test. This test calls for the controlled storage at 54°C to 55°C for 14 days and subsequent analysis. In simple cases, it will be enough to determine a characteristic property before and after storage. The substance is considered to be stable at room temperature if the melting point has remained constant or the content of original substance as determined by analysis has decreased by not more than 5 per cent.

In the thermal analysis methods (TGA and DTA), the sample and the standard reference material are heated up to the final temperature at a constant rate in a defined test atmosphere, either separately in a TGA or DTA apparatus, or in a combined system. The weight change of the sample or the quantities of heat absorbed or given off are measured and recorded. The substance is considered to be stable at room temperature if no decomposition or chemical transformation is found below 150°.

The method described in this Test Guideline is designed for the evaluation of the mineralisation rate of a 14C-labelled compound in soil. The method is applicable to volatile or non-volatile, soluble or insoluble compounds which are not inhibitory to micro-organisms.

The basic test consists on the treatment of a small sample of soil (50g) with the 14C-labelled test chemical (100µl) in a biometer flask apparatus. The soil and the radioactive test solution are mixed. In addition, an equivalent volume of test solution is placed in a 100 ml volumetric flask for direct determination of the added radioactivity. The biometer flask is closed with a stopper through which an Ascarite filter is inserted. The unit is charged by injecting 10 ml of alkali solution into the side tube. Experiment duration times of 1, 2, 4, 8, 16, 32 and - if necessary - 64 days should be chosen for measurement. The test requires parallel determinations. The method can included optional experiments: for chemicals of a vapour pressure higher than 0.0133 Pa and for relatively persistent chemicals. Release of 14CO2 from the test chemical is measured by means of alkali absorption and liquid scintillation counting. The 14CO2 radioactivity recovered is plotted versus time. Incubation time is sufficient when a total of 50 per cent CO2 expressed as 14C originally applied can be measured. Incubation should be stopped after reaching 64 days, whether or not this value is obtained.

This study relates to the analysis, via dermal application, of the health hazard of solid or liquid test substance.

This method is composed of two tests: the main test and the limit test. This Test Guideline is intended for use with the adult rat, rabbit or guinea pig. At least 10 animals (5 female and 5 male) with healthy skin should be used at each dose level (at least three). The highest dose level should result in toxic effects but not produce an incidence of fatalities. The limit test corresponds to one dose level of at least 1000 mg/kg body weight. The method is based on the repeated application of the substance of interest during one limited period (several hours daily during 21/28 days). The test substance should be applied over not less than 10 per cent of the body surface area. The results of this study include: measurements and daily and detailed observations (haematology, clinical biochemistry and urinalysis), as well as gross necropsy and histopathology. A properly conducted 21-day or 28-day study should provide information on the effects of repeated inhalation exposure and can indicate the need for further longer term studies and provide information on the dose levels of the latter.

Cette Ligne directrice décrit une méthode qui est une adaptation de la méthode semi-continue en présence de boue activée (SCAS), mise au point par la « Soap and Detergent Association », pour évaluer la biodégradation primaire de l'alkylbenzène sulfonate. L'essai ne simule pas les conditions réelles d’une installation de traitement d'eaux d'égout.

Les boues activées d'une station de traitement d'eaux d'égout sont déposées dans une unité d'aération. Le composé d'essai (non-volatil, hydrosoluble, organique, non inhibitrice de bactéries à la concentration d'essai) et de l’eau d'égout domestique décantée sont ajoutés, et le mélange est aéré pendant 23 heures. L'aération est alors arrêtée, la boue est décantée et le surnageant est retiré. La boue restante dans la chambre d'aération est alors mélangée à une nouvelle portion de composé d'essai et d'eau d'égout, puis le cycle est recommencé. Les opérations de remplissage et de soutirage sont répétées quotidiennement pendant toute la durée de l'essai. Une concentration élevée des micro-organismes aérobies est employée. La durée de l'essai pour des composés montrant peu ou pas de biodégradation est indéterminée, mais l'expérience suggère que cette durée devrait être au moins de 12 semaines. La biodégradation est déterminée par la teneur en carbone organique dissous dans le liquide surnageant. Ce résultat est comparé à celui obtenu dans un tube contenant une solution témoin réalisée uniquement avec de l'eau d'égout décantée.

Cette Ligne directrice décrit la méthode polarographique. La faculté d'une substance à former des complexes avec des métaux peut être évaluée à l'aide de techniques polarographiques qui permettent de déterminer les constantes d'équilibre de certains complexes.

La méthode polarographique peut être appliquée à des substances dont la solubilité dans l'eau est supérieure à 10-5M. Cette méthode est basée sur le fait qu'à la suite de la formation de complexes, les potentiels de réduction des ions métalliques sont déplacés, en général vers des valeurs plus négatives. Un minimum de quatre concentrations connues du produit chimique étudié, et une concentration connue en ions métalliques devraient être employées. Le produit chimique à étudier doit normalement avoir une concentration au moins 25 fois supérieure à celle des ions métalliques. On doit mesurer le courant pour des potentiels appliqués variant de - 0,2V à - 1,0V. Afin de détecter les complexes qui se forment lentement, il est nécessaire de laisser reposer les solutions pendant au moins 24 heures sous atmosphère d'azote. Si les résultats ne sont pas significatifs, il est nécessaire d'utiliser des méthodes basées sur des principes physico-chimiques différents, telles que la spectrophotométrie ou la spectrométrie par résonance magnétique nucléaire.

Cette Ligne directrice décrit des méthodes pour déterminer la stabilité de stockage d'une substance par rapport à la chaleur et à l'air. Deux méthodes s'appliquent aux substances homogènes solides et liquides ainsi qu’à leurs mélanges : l'essai de stockage accéléré et les méthodes d'analyse thermique.

Dans l’essai de stockage accéléré (CIPAC), une instabilité lors d’un stockage de longue durée peut être simulée en appliquant une température plus élevée pendant un essai court. Cet essai consiste à stocker la substance étudiée entre 54°C et 55°C pendant 14 jours puis à l'analyser. Dans des cas simples, il sera suffisant de déterminer une propriété caractéristique avant et après le stockage. La substance est considérée stable à la température ambiante si le point de fusion est resté constant ou si la teneur en substance originale déterminée par analyse n’a pas diminué de plus de 5 pour cent. Dans les méthodes d'analyse thermique (ATG et ATD), l'échantillon et le produit de référence sont chauffés, avec une élévation constante, jusqu'à la température finale dans une atmosphère d'essai définie, soit séparément dans un appareillage ATG ou ATD, soit dans un système combiné. Les modifications de poids de l'échantillon ou les quantités de la chaleur absorbées ou dégagées sont mesurés et enregistrés. La substance est considérée stable à la température ambiante si aucune décomposition ou transformation chimique n'est trouvée en dessous de 150°.

La méthode décrite dans cette Ligne directrice est destinée à l'évaluation du taux de minéralisation dans le sol d'un composé marqué au 14C. La méthode s'applique aux composés volatils ou non, solubles ou non, qui n’inhibent pas les micro-organismes.

L'essai de base comporte le traitement d'un petit échantillon du sol (50g) avec le produit chimique de l'essai marqué au 14C (100µl) dans un flacon biomètre. Le sol et la solution d'essai radioactive sont mélangés. De surcroît, un volume équivalent de la solution d'essai est placé dans un récipient jaugé de 100 ml pour mesurer directement la radioactivité ajoutée. Le flacon biomètre est fermé avec un bouchon dans lequel un filtre Ascarite est inséré. L’appareil est chargé en injectant 10 ml de potasse dans le tube latéral. Des durées d'expérience de 1, 2, 4, 8, 16, 32 et - au besoin - 64 jours doivent être choisies pour la mesure. L'essai exige des déterminations parallèles. La méthode peut inclure des expériences facultatives pour des produits chimiques dont la pression de vapeur est de plus de 0.0133 Pa et pour des produits chimiques relativement persistants. Le dégagement de 14CO2 du produit chimique d'essai est mesuré grâce à l'absorption sur alcali et un comptage par scintillation liquide. La radioactivité du 14CO2 récupéré est portée sur un graphique en fonction du temps. Le temps d'incubation est suffisant quand un total de 50 pour cent de CO2 formé à partir du 14C introduit au départ peut être mesuré. L'incubation doit être arrêtée au bout de 64 jours, que cette valeur soit obtenue ou non.

Cette méthode fournit des informations sur les dangers pour la santé qui peuvent résulter d’une exposition à une substance d’essai solide ou liquide par voie dermique.

Cette méthode est composée de deux essais : l’essai principal et l’essai limite. Cette Ligne directrice utilise le rat adulte, le lapin ou le cobaye. Pour chaque dose (au moins trois) au moins dix animaux avec une peau saine (cinq femelles et cinq mâles) sont utilisés. La plus forte dose doit provoquer un effet toxique mais pas de mortalité. Un essai limite d’au moins 1000 mg/kg peut être fait. La méthode est basée sur l’application répétée de la substance d’intérêt pendant une période limitée (plusieurs heures quotidiennement pendant 21/28 jours). La substance d’essai doit être appliquée sur pas moins de 10 pourcent de la surface du corps. Les résultats de l’étude comportent : des mesures et des observations quotidiennes détaillées (hématologie, biochimie clinique et analyse d’urine), de même qu’une autopsie générale et de l’histopathologie. Correctement conduite, une étude de 21 jours ou de 28 jours fournit des informations sur les effets de l'exposition répétée par inhalation et peut indiquer le besoin d'autres d'études à plus long terme et fournir des informations sur les niveaux de dose de ces dernières.

This Test Guideline describes the polarographic method. The ability of a substance to form complexes with metals can be assessed by means of polarographic techniques which allow the determination of stability constants for some complexes.

The polarographic method can be applied to substances with a water solubility greater than 10-5 M. This method is based on the fact that the reduction potentials of metal ions are shifted, usually to more negative values, as a result of complex formation. A minimum of four known concentrations of the chemical being tested should be investigated with a known concentration of metal ions. The chemical being tested should normally be present in at least a 25-fold excess over the metal ion concentrations. The current should be measured at applied potentials in the range - 0.2 V to -1.0 V. In order to detect complexes which form slowly, it is necessary to allow the solutions to stand under a nitrogen atmosphere for a minimum period of 24 hours. If the results are not significant, it is necessary to use methods based on different physicochemical principles, such as spectrophotometry or nuclear magnetic resonance spectrometry.

Cette Ligne directrice décrit une méthode pour déterminer la liposolubilité des substances solides et liquides. La liposolubilité d'une substance est l'une des données pour évaluer le stockage des matériaux lipidiques solubles dans les tissus biologiques.

Cette méthode d'essai peut seulement être appliquée aux substances pures, qui ne réagissent pas avec les triglycérides, qui sont stables à 50°C pendant au moins 24 heures et qui ne sont également pas sensiblement volatiles dans les mêmes conditions. La substance est dissoute par agitation dans « une graisse de référence » liquide, et la fraction massique de saturation de la substance est déterminée par addition continue, jusqu'à ce que la variable dépendant de la fraction massique, mesurée par une méthode analytique appropriée, atteigne une valeur constante. Les méthodes emploient huit échantillons, chacun doit correspondre au double de la quantité nécessaire pour la saturation qui a été déterminée dans l'essai préliminaire. Après avoir ajouté une quantité pesée d’approximativement 25 g de graisse de référence liquéfiée et mélangée, quatre flacons sont remués à 30°C (groupe I) et les quatre autres à environ 50°C (groupe II), chaque flacon pendant au moins une heure. Tous les flacons sont remués à 37°C, pour les liquides pendant 3 heures pour deux flacons de chaque groupe et pendant au moins 24 heures pour les deux derniers flacons. À la fin un échantillon est prélevé, pesé et la fraction de masse est déterminée avec différentes méthodes (méthodes photométriques, chromatographie en phase gazeuse, et extraction).

Cette méthode fournit des informations sur les dangers pour la santé qui peuvent résulter d’une exposition à une substance d’essai solide ou liquide par voie dermique. Elle peut être utilisée après avoir obtenu des informations initiales par l'essai de toxicité aiguë.

Cette méthode est composée de deux essais : l’essai principal et l’essai limite. Cette Ligne directrice utilise le rat adulte, le lapin ou le cobaye. Pour chaque dose (au moins trois) au moins 20 animaux avec une peau saine (dix femelles et dix mâles) sont utilisés. La plus forte dose doit provoquer un effet toxique mais pas de mortalité. Un essai limite d’au moins 1000 mg/kg peut être fait. La méthode est basée sur l’application répétée de la substance d’intérêt pendant une période limitée (plusieurs heures, quotidiennement, pendant 90 jours). La substance d’essai doit être appliquée sur au moins 10 pourcent de la surface du corps. Les résultats de l’étude comportent des mesures et des observations quotidiennes détaillées (examen ophtalmologique, hématologie, biochimie clinique et analyse d’urine), de même qu’une autopsie générale et de l’histopathologie. Un essai sub-chronique correctement effectué devrait fournir une évaluation satisfaisante d'un niveau sans effet.

Cette Ligne directrice décrit deux méthodes. Ces tests sont applicables uniquement à des substances insolubles dans l’eau (solubilité < 10-6g/l).

La première (méthode A) sert à fournir des informations sur le transport et la sédimentation de particules insolubles dans l’eau et l’air. Il y a plusieurs méthodes standards disponibles qui répondent aux conditions de sensibilité : la sédimentation, la centrifugation ou le compteur Coulter. L'échantillon est soumis à un examen au microscopique à lumière ordinaire pour déterminer la nature approximative de ses particules. Des données sont obtenues pour 3 domaines de taille différents : > 200 µm, < 2 µm et de 2 à 200 µm. La méthode A, qui détermine le rayon hydrodynamique effectif Rs (seulement pour 2 μm < Rs < 100 μm), sera utilisée pour les produits particulaires qu'ils soient fibreux ou non fibreux.

La méthode B est employée dans le cas spécial des matériaux qui peuvent prendre la forme de fibre ; elle est plus spécialisée, peu fréquemment requise et implique un examen microscopique. La microscopie électronique de balayage (MEB) ou de transmission (MET) sont exigées. Il n'y a aucun procédé standard actuellement. La longueur totale (l) et le diamètre (d) des fibres de d≥ 0.1µm et l≥ 5µm sont demandés. Deux histogrammes sont préparés basés sur l'examen d’au moins 50 fibres chacun.

Cette Ligne directrice décrit les méthodes permettant la détermination des constantes de dissociation dans l'eau. La dissociation est le partage réversible en deux ou plusieurs espèces chimiques qui peuvent être ioniques.

La détermination de la constante de dissociation exige une mesure des concentrations des formes dissociées et non dissociées de la substance chimique. A partir d'une connaissance de la stoechiométrie de la réaction de dissociation la constante appropriée peut être déterminée. Dans le cas particulier décrit dans cette directive, la substance se comporte comme acide ou base, et il est plus facile d’effectuer la détermination en mesurant les concentrations relatives des formes ionisées et non-ionisées de la substance et le pH de la solution. Le rapport entre ces termes est donné dans l'équation donnant le pKa. Quelques composés montrent plus d'une constante de dissociation. Certaines des méthodes décrites sont également appropriées aux dissociations non-acide/basse. Il y a deux façons de déterminer le pKa. L’une consiste à titrer une quantité connue de substance par un acide ou une base de référence selon le cas; l'autre consiste à déterminer les concentrations relatives des formes ionisées et non-ionisées ainsi que leurs variations en fonction du pH. Les méthodes basées sur ces principes peuvent être classées comme procédures de titration, spectrophotométriques et conductimétriques.