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This Test Guideline describes a method to estimate the developmental toxicity of a test chemical to the dung dwelling life stages of dung-dependent dipteran species. Two test species can be used. The test chemical is mixed with bovine faeces, to which either 10 eggs of Scathophaga stercoraria or 10 larvae of Musca autumnalis are added. The test will be terminated 5 days after emergence of the last adult in the control (> 18 days for S. stercoraria, >13 days for M. autumnalis). Then the possible impacts of the test chemical on the following measurement endpoints are assessed under controlled conditions: sex and total number of emerged adult flies, retardation of emergence indicated by the developmental rate and morphological change. Depending on the experimental design, the No Observed Effect Concentration (NOEC) or the Effect concentration for x percent effect (ECx) can be determined. This Guideline can be used for water soluble or insoluble substances, but is not applicable to volatile substances. If the toxicity of the chemical is unknown, five nominal test concentrations should be conducted. A positive control should be tested periodically. The test is considered valid if in the controls hatching of larvae is superior or equal to 70% of the number of introduced eggs, emergence of adults is superior or equal to 70% and superior or equal to 50% of the respectively hatched and introduced larvae and if the emergence of adult flies starts after 18 +- 2 days (S. stercoraria) or after 13 +- 2 days(M. autumnalis).
The Potamopyrgus antopodarumon reproduction test is designed to assess potential effects of prolonged exposure to chemicals on reproduction and survival of parthenogenetic lineages of the freshwater mudsnail Potamopyrgus antipodarum. Adult female P. antipodarum are exposed to a concentration range of the test chemical. The test chemical is dispersed into the reconstituted dilution water, added to test beakers, and adult snails are subsequently introduced into the test beakers. When testing “difficult chemicals” (i.e. volatile, unstable, readily biodegradable and adsorbing chemicals) the test can be conducted under flow-through conditions as an alternative to the semi-static design with fixed renewal periods of the medium (see paragraph 29). P. antipodarum survival over the 28 days exposure period and reproduction at the end of the test after 28 days are examined. Reproduction is evaluated by counting the number of embryo in the brood pouch (without distinction of developmental stages) at the end of 28 days exposure. The toxic effect of the test chemical on embryo numbers is expressed as ECX by fitting an appropriate regression model in order to estimate the concentration that would cause x % reduction in embryo numbers or alternatively as the No Observed Effect Concentration and Lowest Observed Effect Concentration (NOEC/LOEC) value (2).
This Test Guideline is designed to be used for assessing the effects of chemicals on the reproductive output of the enchytraeid worm, Enchytraeus albidus Henle 1873, in soil.
Adult enchytraeid worms are exposed to a range of concentrations of the test substance mixed into an artificial soil. Ten worms are randomly allocated to each test vessel. A range-finding test should be used, for two weeks, in case of no sufficient information. The duration of the definitive test is six weeks. At the end the total number of juveniles produced by parent animal and the survival of parent animals are assessed. The limit test corresponds to one dose level of 1000 mg/kg. The study report should include the adult morphological changes, the number of offspring. The reproductive output of the animals exposed to the test substance is compared to that of the control(s) in order to determine the no observed effect concentration (NOEC) and/or ECx by using a regression model to estimate the concentration that would cause a x % reduction in reproductive output. The test concentrations should bracket the ECx so that the ECx then comes from interpolation rather than extrapolation.
The in vitro mammalian cell gene mutation test can be used to detect gene mutations induced by chemical substances. In this test, the used genetic endpoints measure mutation at hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase (HPRT), and at a transgene of xanthineguanine phosphoribosyl transferase (XPRT). The HPRT and XPRT mutation tests detect different spectra of genetic events.
Cells in suspension or monolayer culture are exposed to, at least four analysable concentrations of the test substance, both with and without metabolic activation, for a suitable period of time. They are subcultured to determine cytotoxicity and to allow phenotypic expression prior to mutant selection. Cytotoxicity is usually determined by measuring the relative cloning efficiency (survival) or relative total growth of the cultures after the treatment period. The treated cultures are maintained in growth medium for a sufficient period of time, characteristic of each selected locus and cell type, to allow near-optimal phenotypic expression of induced mutations. Mutant frequency is determined by seeding known numbers of cells in medium containing the selective agent to detect mutant cells, and in medium without selective agent to determine the cloning efficiency (viability). After a suitable incubation time, colonies are counted.
The in vitro mammalian cell gene mutation test can be used to detect gene mutations induced by chemical substances. This TG includes two distinct in vitro mammalian gene mutation assays requiring two specific tk heterozygous cells lines: L5178Y tk+/-3.7.2C cells for the mouse lymphoma assay (MLA) and TK6 tk+/- cells for the TK6 assay. Genetic events detected using the tk locus include both gene mutations and chromosomal events.
Cells in suspension or monolayer culture are exposed to, at least four analysable concentrations of the test substance, both with and without metabolic activation, for a suitable period of time. They are subcultured to determine cytotoxicity and to allow phenotypic expression prior to mutant selection. Cytotoxicity is usually determined by measuring the relative cloning efficiency (survival) or relative total growth of the cultures after the treatment period. The treated cultures are maintained in growth medium for a sufficient period of time, characteristic of each selected locus and cell type, to allow near-optimal phenotypic expression of induced mutations. Mutant frequency is determined by seeding known numbers of cells in medium containing the selective agent to detect mutant cells, and in medium without selective agent to determine the cloning efficiency (viability). After a suitable incubation time, colonies are counted.
The mammalian in vivo micronucleus test is used for the detection of damage induced by the test substance to the chromosomes or the mitotic apparatus of erythroblasts, by analysis of erythrocytes as sampled in bone marrow and/or peripheral blood cells of animals, usually rodents (mice or rats).
The purpose of the micronucleus test is to identify substances (liquid or solid) that cause cytogenetic damage which results in the formation of micronuclei containing lagging chromosome fragments or whole chromosomes. An increase in the frequency of micronucleated polychromatic erythrocytes in treated animals is an indication of induced chromosome damage. Animals are exposed to the test substance by an appropriate route (usually by gavage using a stomach tube or a suitable intubation cannula, or by intraperitoneal injection). Bone marrow and/or blood cells are collected, prepared and stained. Preparations are analyzed for the presence of micronuclei. Each treated and control group must include at least 5 analysable animals per sex. Administration of the treatments consists of a single dose of test substance or two daily doses (or more). The limit dose is 2000 mg/kg/body weight/day for treatment up to 14 days, and 1000 mg/kg/body weight/day for treatment longer than 14 days.
The purpose of the in vitro chromosome aberration test is to identify agents that cause structural chromosome aberrations in cultured mammalian somatic cells. Structural aberrations may be of two types: chromosome or chromatid.
The in vitro chromosome aberration test may employ cultures of established cell lines, cell strains or primary cell cultures. Cell cultures are exposed to the test substance (liquid or solid) both with and without metabolic activation during about 1.5 normal cell cycle lengths. At least three analysable concentrations of the test substance should be used. At each concentration duplicate cultures should normally be used. At predetermined intervals after exposure of cell cultures to the test substance, the cells are treated with a metaphase-arresting substance, harvested, stained. Metaphase cells are analysed microscopically for the presence of chromosome aberrations.
This test measures structural chromosomal aberrations (both chromosome- and chromatid-type) in dividing spermatogonial germ cells and is, therefore, expected to be predictive of induction of heritable mutations in these germ cells. The purpose of the in vivo mammalian spermatogonial chromosomal aberration test is to identify those chemicals that cause structural chromosomal aberrations in mammalian spermatogonial cells (1) (2) (3). In addition, this test is relevant to assessing genetoxicity because, although they may vary among species, factors of in vivo metabolism, pharmacokinetics and DNA-repair processes are active and contribute to the response.
The original Test Guideline 483 was adopted in 1997. This modified version of the Test Guideline reflects many years of experience with this assay and the potential for integrating or combining this test with other toxicity or genotoxicity studies.
This screening Test Guideline describes the effects of a test chemical on male and female reproductive performance. It has been updated with endocrine disruptor endpoints, in particular measure of anogenital distance and male nipple retention in pups and thyroid examination.
The test substance is administered in graduated doses to several groups of males and females. Males should be dosed for a minimum of four weeks. Females should be dosed throughout the study, so approximately 63 days. Matings "one male to one female" should normally be used in this study. This Test Guideline is designed for use with the rat. It is recommended that each group be started with at least 10 animals of each sex. Generally, at least three test groups and a control group should be used. Dose levels may be based on information from acute toxicity tests or on results from repeated dose studies. The test substance is administered orally and daily. The results of this study include clinical observations, body weight and food/water consumption, oestrous cycle monitoring, offspring parameters observation/measurement, thyroid hormone measurement, as well as gross necropsy and histopathology. The findings of this toxicity study should be evaluated in terms of the observed effects, necropsy and microscopic findings. Because of the short period of treatment of the male, the histopathology of the testis and epididymus should be considered along with the fertility data, when assessing male reproductive effects.
This screening Test Guideline describes the effects of a test chemical on male and female reproductive performance. It has been updated with endocrine disruptor endpoints, in particular measure of anogenital distance and male nipple retention in pups and thyroid examination.
The test substance is administered in graduated doses to several groups of males and females. Males should be dosed for a minimum of four weeks. Females should be dosed throughout the study, so approximately 63 days. Matings "one male to one female" should normally be used in this study. This Test Guideline is designed for use with the rat. It is recommended that each group be started with at least 10 animals of each sex. Generally, at least three test groups and a control group should be used. Dose levels may be based on information from acute toxicity tests or on results from repeated dose studies. The test substance is administered orally and daily. The results of this study include clinical observations, body weight and food/water consumption, oestrous cycle monitoring, offspring parameters observation/measurement, thyroid hormone measurement, as well as gross necropsy and histopathology. The findings of this toxicity study should be evaluated in terms of the observed effects, necropsy and microscopic findings. Because of the short period of treatment of the male, the histopathology of the testis and epididymus should be considered along with the fertility data, when assessing male reproductive effects.
La présente ligne directrice décrit les effets d'un produit chimique d’essai sur le fonctionnement de la reproduction chez le mâle et la femelle. Elle a été mise à jour par l'ajout de paramètres relatifs à la détection des perturbateurs endocriniens, en particulier la mesure de la distance ano-génitale et l’examen de la persistance du mamelon chez les petits, ainsi qu'un examen thyroïdien.
La substance d’essai est administrée par doses graduées à plusieurs groupes de mâles et de femelles. Les mâles doivent être traités pendant au moins quatre semaines ; les femelles doivent être traitées tout au long de l’étude (approximativement 63 jours). Normalement des accouplements « un mâle pour une femelle » doivent être employés dans cette étude. Cette Ligne directrice utilise le rat. Il est recommandé que la substance d’essai soit administrée oralement par gavage. Ceci devrait être fait avec une dose unique quotidienne en utilisant une sonde gastrique ou une canule d'intubation appropriée. Chaque groupe devrait initialement inclure au moins 10 animaux de chaque sexe. Généralement, au moins trois groupes d'essai et un groupe de contrôle devraient être employés. Des niveaux de dose devraient être choisis, en tenant compte de toutes données de toxicité existantes et de (toxico-) cinétique disponibles. Les résultats de cette étude incluent des observations cliniques, la mesure du poids corporel et la consommation de nourriture/eau, la surveillance du cycle œstral, la mesure/observation des caractéristiques de la descendance, un examen hématologique et de biochimie clinique, de même qu’une autopsie générale et l'histopathologie. Les résultats de cette étude de toxicité devraient être évalués en termes d'effets observés, autopsie et résultats microscopiques. L'évaluation inclura le rapport entre la dose de la substance d'essai et la présence ou l'absence d’observations. En raison de la période courte du traitement du mâle, l'histopathologie du testicule et l'épididyme doivent être pris en compte avec les données de fertilité, lors de l’évaluation des effets reproducteurs mâles.
Cet essai mesure les aberrations chromosomiques structurales (de type chromosomique et chromatidique) qui surviennent dans les spermatogonies et devrait par conséquent permettre de prévoir l'induction de mutations héritées dans les cellules germinales. L’essai d’aberration chromosomique pratiqué in vivo sur des spermatogonies de mammifères est destiné à détecter les produits chimiques qui causent des aberrations chromosomiques structurales dans les cellules de spermatogonies de mammifère (1) (2) (3). Par ailleurs, cet essai se prête bien à l’évaluation de la génotoxicité, car, malgré des variations entre les espèces, les facteurs du métabolisme in vivo, la pharmacocinétique et les processus de réparation de l’ADN sont actifs et contribuent aux réponses.
La Ligne directrice 483 originale a été adoptée en 1997. La présente version modifiée de la ligne directrice reflète les connaissances scientifiques acquises après de nombreuses années d’expérience de cet essai et tient compte des possibilités de l’intégrer ou de le combiner à d’autres études de toxicité ou de génotoxicité.
Le but de l'essai in vitro d'aberration chromosomique est d'identifier les agents qui causent des aberrations chromosomiques structurales dans les cellules mammifères cultivées. Les aberrations structurales peuvent être de deux types : chromosomiques ou chromatidiques.
L'essai in vitro d'aberration chromosomique peut utiliser des cultures de lignées cellulaires établies, des souches cellulaires ou des cultures de cellules primaires. Des cultures cellulaires sont exposées à la substance d'essai (liquide ou solide) avec et sans activation métabolique pendant environ 1.5 fois le cycle cellulaire normal. Au moins trois concentrations analysables de la substance d'essai devraient être employées. Il faut normalement réaliser les cultures en doublon à chaque niveau de dose. À intervalles prédéterminés après exposition des cultures de cellules à la substance d'essai, les cellules sont traitées avec une substance qui bloque la métaphase, récoltées et teintées. Les cellules métaphasiques sont analysées au microscope pour déceler les aberrations chromosomiques.
The purpose of the Dominant lethal (DL) test is to investigate whether chemical agents produce mutations resulting from chromosomal aberrations in germ cells. In addition, the dominant lethal test is relevant to assessing genotoxicity because, although they may vary among species, factors of in vivo metabolism, pharmacokinetics and DNA-repair processes are active and contribute to the response. Induction of a DL mutation after exposure to a test chemical indicates that the chemical has affected germinal tissue of the test animal.
This modified version of the Test Guideline reflects more than thirty years of experience with this test and the potential for integrating or combining this test with other toxicity tests such as developmental, reproductive toxicity, or genotoxicity studies; however due to its limitations and the use of a large number of animals this assay is not intended for use as a primary method, but rather as a supplemental test method which can only be used when there is no alternative for regulatory requirements.
The in vivo alkaline single cell gel electrophoresis assay, also called alkaline Comet Assay is a method measuring DNA strand breaks in eukaryotic cells.
Each treated group is composed of a minimum of 5 animals of one sex (or of each sex as appropriate). A positive and a vehicle control group are also used. Administration of the treatment consists of daily doses over duration of 2 days or more, ensuring the test chemical reaches the target tissue which can be the liver, the kidney or other tissues if justified.
Tissues of interest are dissected and single cells/nuclei suspensions are prepared and embedded in agarose on slides. Cells/nuclei are treated with lysis buffer to remove cellular and/or nuclear membranes. The nuclear DNA in the agar is then subjected to electrophoresis at high pH. This results in structures resembling comets which by using suitable fluorescent stain, can be observed by fluorescent microscopy. Based on their size DNA fragments migrate away from the head to the tail, and the intensity of the comet tail relative to the total intensity (head plus tail) reflects the amount of DNA breakage.
The mammalian in vivo chromosome aberration test is used for the detection of structural chromosome aberrations induced by test compounds in bone marrow cells of animals, usually rodents (rats, mice and Chinese hamsters). Structural chromosome aberrations may be of two types: chromosome or chromatid.
Animals are exposed to the test substance (liquid or solid) by an appropriate route of exposure (usually by gavage using a stomach tube or a suitable intubation cannula, or by intraperitoneal injection) and are sacrificed at appropriate times after treatment. Prior to sacrifice, animals are treated with a metaphase-arresting agent. Chromosome preparations are then made from the bone marrow cells and stained, and metaphase cells are analysed for chromosome aberrations. Each treated and control group must include at least 5 analysable animals per sex. The limit dose is 2000 mg/kg/body weight/day for treatment up to 14 days, and 1000 mg/kg/body weight/day for treatment longer than 14 days.
L’essai de mutation létale dominante a pour but de détecter si certaines substances chimiques engendrent des mutations résultant d’aberrations chromosomiques dans les cellules germinales. En outre, l’essai de mutation létale dominante se prête bien à l’évaluation de la génotoxicité, car, malgré des variations entre les espèces, les facteurs du métabolisme in vivo, la pharmacocinétique et les processus de réparation de l’ADN sont actifs et contribuent aux réponses. L’apparition d’une mutation létale dominante à la suite d’une exposition à un produit chimique d’essai indique que cette substance a affecté le tissu germinal de l’animal étudié.
La LD 478 initiale a été adoptée en 1984. La présente version modifiée de cette ligne directrice reflète plus de trente années d’expérience de cet essai et tient compte des possibilités de l’intégrer ou de le combiner à d’autres essais de toxicité, notamment pour le développement, la reproduction ou encore des essais de génotoxicité; cependant, étant donné les limitations de l’essai et le grand nombre d’animaux utilisés, cet essai n’a pas vocation à être utilisé en première intention, mais plutôt comme méthode d’essai supplémentaire quand il n’existe pas d’alternative pour satisfaire les exigences réglementaire.
L’essai in vivo d’électrophorèse sur gel en conditions alcalines de cellules isolées, aussi appelé test des comètes est une méthode mesurant les cassures de brins d’ADN dans les cellules eucaryotes.
Chaque groupe traité est composé au minimum de 5 animaux d’un même sexe (ou de chaque sexe si besoin est). On utilise également un groupe témoin positif et un groupe témoin négatif. Les animaux reçoivent un traitement quotidien sur une durée de 2 jours ou plus, permettant au produit chimique d’essai d’atteindre le tissu cible, celui-ci peut être le foie, le rein, ou tous autres tissus si cela est justifié.
Les tissus à étudier sont disséqués et des suspensions de cellules/noyaux isolés sont préparées, puis incluses dans un gel d’Agarose pour être fixé sur des lames. Les cellules/noyaux sont traitées avec un tampon de lyse pour éliminer la membrane cellulaire et/ou nucléaire. L’ADN nucléaire dans l’agar est ensuite soumis à une électrophorèse à pH élevé produisant des structures ressemblant à des comètes qui, si l’on utilise les colorants fluorescents appropriés, peuvent être observées par microscopie à fluorescence. En fonction de leur taille les fragments d’ADN migrent de la tête vers la queue de la comète, et l’intensité de la queue de la comète relative à l’intensité totale (tête plus queue) reflète l’ampleur des cassures de l’ADN.
La présente ligne directrice décrit les effets d'un produit chimique d’essai sur le fonctionnement de la reproduction chez le mâle et la femelle. Elle a été mise à jour par l'ajout de paramètres relatifs à la détection des perturbateurs endocriniens, en particulier la mesure de la distance ano-génitale et l’examen de la persistance du mamelon chez les petits, ainsi qu'un examen thyroïdien.
La substance d’essai est administrée en doses graduées à plusieurs groupes de mâles et de femelles. Les mâles doivent être traités pendant un minimum de quatre semaines. Les femelles doivent être traitées tout au long de l’étude, soit approximativement 63 jours. Normalement des accouplements « un mâle pour une femelle » doivent être employés dans cette étude. Cette Ligne directrice utilise le rat. Il est recommandé que chaque groupe commence avec au moins dix animaux de chaque sexe. Généralement, au moins trois groupes d’essai et un groupe contrôle doivent être utilisés. Des niveaux de dose peuvent être basés sur l'information des essais de toxicité aiguë ou sur des résultats d’études à doses répétées. La substance d'essai est administrée oralement et quotidiennement. Les résultats de cette étude incluent des observations cliniques, la mesure du poids corporel et la consommation de nourriture/eau, la surveillance du cycle oestral, la mesure/observation des caractéristiques de la descendance, la mesure du taux sérique d'hormones thyroïdiennes, de même qu’une autopsie générale et l'histopathologie. Les résultats de cette étude de toxicité devraient être évalués en termes d'effets observés, autopsie et résultats microscopiques. En raison de la période courte du traitement du mâle, l'histopathologie du testicule et l'épididyme doivent être pris en compte avec les données de fertilité, lors de l’évaluation des effets reproducteurs mâles.
L'essai d'aberration chromosomique in vivo sur mammifères est employé à l’identification des composés d'essai qui induisent des aberrations structurales dans des cellules de moelle osseuse d’animaux, généralement des rongeurs (rats, souris et hamsters chinois). Les aberrations structurales peuvent être de deux types : chromosomiques ou chromatidiques.
Des animaux sont exposés à la substance d'essai (liquide ou solide) par une voie d'exposition appropriée (habituellement par gavage via une sonde gastrique ou d’une canule de tubage appropriée, ou par injection intrapéritonéale) et sont sacrifiés après des délais appropriés de traitement. Avant le sacrifice, les animaux sont traités avec un inhibiteur de fuseau. Des préparations chromosomiques sont alors faites à partir des cellules de moelle et colorées, et des cellules de métaphase sont analysées pour mettre en évidence les aberrations chromosomiques. Chacun des groupes traités et de contrôle doivent inclure au moins 5 animaux analysables par sexe. La dose de limite est 2000 de mg/kg pc/jour pour le traitement jusqu'à 14 jours, et de 1000 mg/kg pc/jour pour le traitement de plus de 14 jours.