Cette méthode fournit des informations sur les dangers pour la santé qui peuvent résulter d’une exposition à une substance d’essai par voie orale. La détermination d’une toxicité sub-chronique orale utilisant des doses répétées peut être effectuée après que l'information initiale sur la toxicité ait été obtenue à partir d’essai de toxicité aiguë ou répétée (28 jours). La méthode est basée sur l’administration orale répétée de la substance étudiée sur une période prolongée (un niveau de dose, quotidiennement, pendant 90 jours). Cette Ligne directrice utilise principalement des rongeurs (de préférence des rats). Au moins 20 animaux (10 femelles et 10 mâles) doivent être employés pour chaque groupe d’essai. Trois concentrations, au moins, doivent être utilisées. Le composant testé est administré par gavage ou via la nourriture ou la boisson. Un essai limite peut être fait quand on n’attend pas d’effet pour une dose de 1000 mg/kg poids corporel/j. Les résultats de l’étude incluent des mesures (le poids au moins une fois par semaine, la consommation de nourriture et d’eau), des observations quotidiennes détaillées (examen ophtalmologique, hématologie, biochimie clinique et analyse d’urine), chaque jour de préférence au même moment, de même qu’une autopsie générale et de l’histopathologie. Un certain nombre de mesures liées aux fonctions endocriniennes, et plus particulièrement à celle de la thyroide, ont été ajoutées en 2018. Un essai sub-chronique de 90 jours correctement effectué devrait fournir une évaluation satisfaisante d'un niveau sans effet.